Aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos
Las colonias más representativas crecidas en Agar petróleo se sembraron por agotamiento en medio Agar triptona soya y se incubaron a 37 o C por 24 h. Para la caracterización cultural se observaron las colonias al estereoscopio y para definir las características morfológicas tintoriales se realizó la tinción de Gram. (Bergey´s Manual, 1974)
· Caracterización de las cepas degradadoras
Degradación de Resinas y Asfaltenos: Para determinar la capacidad de estas cepas de degradar crudo pesado se añadió 1% de residuo de destilación mayor que 347 oC y residuo de destilación mayor que 465 oC de Crudo Seboruco en tubos con 9 ml del medio Solanas. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa, los tubos se incubaron durante 21días a 37 0C con un indicador de crecimiento.
Hidrocarburos Alifáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos alifáticos del petróleo como única fuente de carbono se añadió 1 % de queroseno y 1% de Isooctano por separado en tubos con 9 ml de medio Solana. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento.
Hidrocarburos Aromáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos aromáticos se utilizó 1% de Naftaleno (poliaromático) y 1% de Tolueno (Aromático alquilado) en medio basal Solanas por separado. El Naftaleno, como es un sólido insoluble en agua, se disolvió primero en acetona y luego se añadió al medio. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento.
Identificación de las cepas degradadoras: A partir de cultivos frescos de las cepas que crecieron en todos los medios de caracterización se inocularon los Kit de identificación (API 20 NE, 2002) para la identificación de microorganismos Gram negativos no enterobacterias.
· Conteo y aislamiento de bacterias degradadoras del Lodo Residual o Fango Digerido de la planta de tratamiento de aguas residuales del Río Quibú.
En la tabla 1 se muestra el resultado de la caracterización microbiológica del Fango digerido, conteo total de las colonias de bacterias aerobias, hongos y levaduras y microorganismos degradadores expresados en UFC/g.
Tabla. 1. Caracterización microbiológica del Fango digerido, expresados en UFC/g.
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Fango digerido |
Conteo Total de Bacterias aerobias |
Conteo Total de Hongos y Levaduras |
Conteo Total de Microorganismos degradadores de HC |
|
1.54 x 107 |
2.88 x 10 5 |
4.2 x 10 6 |
El número de bacterias aerobias alcanzó valores de 109 UFC/g , los hongos y levaduras hasta 105 UFC/g y los microorganismos degradadores de hidrocarburos resultó elevado con valores que alcanzan hasta 106 UFC / g. Estos resultados se corresponden con la amplia flora característica de los suelos (Bergeys, 1984).
Tabla. 2. Caracterización física – química del Fango digerido. (Álvarez y col., 2004)
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pH |
Densidad aparente |
P |
Grasas y Aceites |
HCTP |
K |
N |
Ca |
Mg |
|
Fango digerido |
6.7 |
0.67g/cm3 |
0.58% |
39.29% |
1.14 % |
0.01% |
2.81% |
10% |
3% |
HCTP: hidrocarburos totales del petróleo
Este sustrato constituye una fuente rica de materia orgánica con altos contenidos de nitrógeno, fósforo y potasio donde aparece un por ciento elevado de grasas y aceites e hidrocarburos totales disueltos en el sedimento con alta biodisponibilidad, además de poseer un pH adecuado para el desarrollo y crecimiento de una abundante microbiota adaptada al consumo de crudo y sus derivados como única fuente de carbono.
Del Conteo total de bacterias aerobias se aislaron 11cepas aparentemente diferentes. En la tabla 3 aparecen las características culturales morfológicas de cada una de ellas.
Según se aprecia en la tabla 3, las bacterias presentaron morfología colonial diversa, lo cual está en concordancia con la riqueza nutricional del lodo residual de donde provienen. Las bacterias aisladas resultaron ser 5 cocobacilos positivos, 3 cocobacilos negativos, 2 bacilos negativos y 1 bacilo positivo.
Tabla3. Características culturales y tintoriales de las cepas aisladas
|
Cepas |
Color |
Forma |
Elevación |
Gram |
Género y especie |
|
LR-1 |
Crema |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Bacilos positivos |
—— |
|
LR-2 |
Rosada |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos positivos |
—— |
|
LR-3 |
Crema verdosa |
Irregular, bordes ondulados |
Plana |
Cocobacilos negativos |
Agrobacter radiobacter |
|
LR-4 |
Amarilla verdosa |
Irregular, bordes ondulados |
Plana |
Cocobacilos positivos |
——- |
|
LR-5 |
Crema verdosa |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos positivos |
Brevundimonas versicularis |
|
LR-7a |
Naranja |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos positivos |
——- |
|
LR-7c |
Amarilla verdosa |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos negativos |
Chyseomonas luteola |
|
LR-9 |
Amarilla verdosa |
Irregular, bordes ondulados |
Plana |
Bacilos negativos |
Brevundimonas versicularis |
|
LR-10 |
Naranja |
Circular ,bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos negativos |
——- |
|
LR-11 |
Naranja |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Cocobacilos positivos |
——- |
|
LR-13 |
Mamoncillo |
Circular, bordes enteros |
Convexa |
Bacilos negativos |
Azomonas agilis |
El estudio microscópico mostró formas bacilares, cocobacilos, Gram positivos y negativos, márgenes lisas e irregulares, convexas y planas, de colores verdes, amarillas y rosadas.
Caracterización de las cepas aisladas degradadoras de hidrocarburos
En la tabla 4 se reportan los resultados de la caracterización de las cepas aisladas del lodo residual o fango digerido utilizando como fuente de carbono y energía las diferentes fracciones del petróleo.
Tabla 4. Resultados de la caracterización de las cepas aisladas del residuo con los diferentes hidrocarburos.
|
Cepas |
Isooctano |
Tolueno |
Crudo Seboruco R>465o C |
Crudo Seboruco R>347o C |
Naftaleno |
Keroseno |
|
LR-1 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-2 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-3 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-4 |
- - |
- - |
- - |
- - |
++ |
++ |
|
LR-5 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-7a |
- - |
- - |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-7c |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-9 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-10 |
++ |
++ |
- - |
++ |
++ |
++ |
|
LR-11 |
++ |
- - |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
LR-13 |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
Las cepas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13 crecieron en todos los medios con los diferentes sustratos como única fuente de carbono y energía (Tabla 4), estas bacterias tuvieron un óptimo crecimiento al final de la incubación con turbidez y cambio de color (Fig. 6), siendo capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos a la que fueron expuestas, por lo que constituyen cepas promisorias para ser utilizadas con diferentes fines degradativos en suelos impactados por hidrocarburos y donde el conteo de microorganismos degradadores de hidrocarburos se encuentre por debajo del rango establecido, entre 10 3 y 10 4 UFC/g, para aplicar el proceso de Biorremediación.
La versatilidad nutricional de las cepas identificadas en estos desechos resulta de significativa importancia, debido a que en el mundo, son pocas las especies microbianas reportadas con potencialidades para degradar todas las fracciones de hidrocarburos simultáneamente. Algunos autores, (Whyte, Bourbonnié y Creer, 1997), reportan que la mayoría de las cepas degradadoras de hidrocarburos pueden mineralizar los compuestos poliaromáticos o alifáticos pero no ambos, sugiriendo que estas dos vías pueden ser excluyentes en muchos casos. Sin embargo, en muchas bacterias se han observado los genes que codifican para las enzimas alcano-monooxigenasa y catecol 2,3 dioxigenasa, lo cual indica que las vías degradativas para alcanos e hidrocarburos aromáticos simples alquilados pueden encontrarse simultáneamente.
Las cepas de bacterias aerobias aisladas e identificadas del lodo residual o fango digerido de la Planta de Tratamiento de aguas residuales urbanas del Río Quibú capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos, pueden servir como materia prima para la obtención de bioproductos (inóculos), para ser empleados en suelos contaminados por hidrocarburos y donde no sea posible la aplicación del proceso de Biorremediación por la técnica de la bioestimulación de los microorganismos autóctonos (Ej. manglares).
Conclusiones y Recomendaciones
El lodo residual o fango digerido caracterizado constituye una fuente importante de nutrientes y microorganismos degradadores de hidrocarburos, por lo que es promisoria su utilización en el proceso de biorremediación de residuos sólidos petrolizados y de suelos impactados por hidrocarburos.
Se identificaron 5 cepas Gram negativas, resultando ser géneros comúnmente aislados de suelos contaminados por hidrocarburos y residuos sólidos petrolizados.
Del total de las bacterias aisladas del lodo residual estudiado, siete resultaron las de mejores resultados biodegradativos utilizando al crudo y sus derivados como única fuente de carbono y energía. Las cepas denominadas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13, son promisorias para su aplicación en diferentes procesos de Biorremediación.
Las cepas aisladas e identificadas del lodo residual o fango digerido pueden ser utilizadas como materia prima para la obtención de bioproductos (inóculos), que pueden ser empleados en el proceso de biorremediación.
Se recomienda evaluar la factibilidad de utilización de los lodos residuales o fangos digeridos de las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales como fuentes de nutrientes y de microorganismos biodegradadores de hidrocarburos en el proceso de Biorremediación de residuos sólidos petrolizados y suelos contaminados por hidrocarburos.
Se debe estudiar la posibilidad de obtención de bioproductos y biosurfactantes a partir de las cepas aisladas e identificadas del lodo residual.
1.Acosta, I; Infante, C. López, W (1995). “Efecto de lodos petrolizados y lodos de tratamiento de aguas servidas sobre un suelo calciorthids de la península de Paraguaya”. Agronomía Trop. 45(4): 527-537.
2.lvarez, JA, y col. (2004). “Aplicación de la Biorremediación para tratar los residuales sólidos petrolizados de fondos de tanques de la Refinería Ñico López.” P 2507, E03. CUPET. C. Habana, Cuba.
3.Ameneiros, J.A, García, O (2003). “Composteo de lodos generados en sistemas de tratamiento de aguas residuales”, CIMAB, La Habana, Cuba
4.Api 20 NE (2002). Bio Mérieux SA. 07615B-11/97. 1-5.
5.Bergey´s (1974). Manual, the Systematic Bacteriology, Volumen I y II
6.Bergey´s (1984).Manual, the Systematic Bacteriology, Volumen I y II
7.Finnerty, W. R., Schokley, K., and Attaway, H, (1983). Microbial desulphurization and denitrogenation of hydrocarbons. Microbial Enhanced Oil Recovery. Penn Well Books, Tulsa, Oklahoma: 83-91
8.ISO 10381 – 6:1993, (1993). (E). International Standard. Guía para la colección, manejo y conservación del suelo para procesos microbianos aeróbicos en el laboratorio.
9.ISO 6887:1993. (1993) (E). International Standard. Microbiology: General guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination (1993).
10. ISO 4833:1991(1991) (E). Microbiology-general guidance for the enumeration of microorganism colony count technique at 30 ° C.
11. ISO 7954:1987 (1987) (E) Microbiología: Guía general para la enumeración de hongos y levaduras. Técnica del conteo de colonias a 25 oC.
12. Medegan, MT (1998). Brock: Biología de los microorganismos 8va ed. Madrid, España
13. Ron, E. Z. y Rosenberg, E (2002). Biosurfactants and Bioremediation. Current opinion in biotechnology 13: 249 – 252.
14. Solana, A.M (1985). Biodegradación marina en la contaminación por hidrocarburos. Mundo Científico. 1(8): 913-920.
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José Alfonso Álvarez González
Gisela Novoa Rodríguez
Silvia Acosta Díaz
Ricardo Campos Rodríguez
Miguel A. Díaz Díaz
Sandra Millar Palmer
Cristina Laffita Rivera
Centro de Investigaciones del Petróleo, Washington # 169, Cerro, Ciudad de la Habana, Cuba.
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